Е.В. Овэс , К.Л. Ле ?, Д. Томас 

Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха,

 Федеральный исследовательский центр «Агроскоп» (Швейцария)

В современной практике для сохранения генетических ресурсов вегетативно размножаемых культур используются базовые и активные коллекции. Базовые  коллекции обеспечивают долгосрочное хранение сортообразцов в специальных условиях (полевые и криоколлекции), активные — способствуют  сохранению образцов  в культуре invitro, при этом к данной категории относится как поддержание при нормальных температурах в виде растущих микрорастений, так и при низких продолжительных температурах, когда их рост замедляется (4).

Во ВНИИКХ для формирования Банка здоровых сортов картофеля (БЗСК) в полевой культуре и invitro базовая коллекция поддерживается в чистых фитосанитарных условиях северной фитогигиены на территории Архангельской области и дублируется в горных условиях Северного Кавказа на высоте 1500м над уровнем моря. Ежегодно на основе клубневого материала поступившего из базовой коллекции проводится обновление линий invitroдля поддержания активной коллекции.

Предназначение активной коллекции заключается в систематическом мониторинге качества поддерживающихся сортообразцов  и линий invitro на наличие патогенов различного происхождения и использования здорового исходного материала в процессе ускоренного микроклонального размножения. В настоящее время активная коллекция на основе БЗСК включает около 80-и сортообразцов. Ежегодно по заявкам региональных НИУ поставляется исходный материал в виде микрорастений не более 30-и сортов. Поддержание в активной коллекции сортов не имеющих коммерческое значение сопровождается огромными материальными затратами включающие как трудовые и производственные, так и затраты на их систематическое тестирование высокочувствительными методами диагностики ИФА и ПЦР-анализа.

Разработанная в настоящее время технология консервации черенков картофеля invitroв виде биокапсул позволяет существенно сократить затраты на поддержание активной коллекции исходного материала в виде микрорастений [1,3,6,7].

Технологический процесс инкапсулирования подразумевает заключение частиц одного вещества или материала в оболочку из другого вещества. Данный вид изоляции проводится для обеспечения сохранности инкапсулируемого объекта на определенный период с целью его защиты от воздействия окружающей среды или других отрицательных факторов.

Для этой цели из микрорастений в стерильных условиях вырезают  сегменты с заложенными пазушными почками (3-4 мм) и переносят в специальный питательный раствор. Далее почки по отдельности размещают в высококонцентрированный раствор хлористого кальция вместе с частью питательного раствора в объеме одной капли. В результате образуется капсула размером  до 5 мм. Приготовленные биокапсулы размещают в стерильные чашки Петри [5,6,7,8]. Оптимальными условиями для хранения биокапсул являются: температура +3-4?С и освещение 1-2 тыс. люкс. Для таких целей целесообразно использовать специализированные инкубаторы, где поддерживается температурный и световой режим. Жизнеспособность инкапсулированных микрочеренков в такие условия может сохраниться до двух  лет Альтернативным способом хранения могут быть бытовые холодильники, однако в отсутствие освещения период консервации существенно сокращается [2,3,7]. При необходимости использования биокапсул в процессе клонального микроразмножения их размещают в пробирку с питательной средой. Регенерация микрорастений зависит от периода хранения  и сортовых особенностей законсервированного экспланта.

В качестве объекта для проведения исследований были использованы микрорастения сортов селекции ВНИИКХ различных сроков созревания Удача, Жуковский ранний, Метеор, Невский, Голубизна и Никулинский.

Для закладки опыта по изучению сохранности биокапсул при различных сроков консервации их размещали в стерильные чашки Петри и хранили при температурном режиме +3-4?С в условиях бытового холодильника. Максимальный период консервации черенков — 12 месяцев, с систематическим контролем сохранности через каждые три месяца. По истечению периода хранения биокапсулы размещали в пробирку с питательной средой с последующим размещением в условиях фитотрона при 16ч фотопериоде. В дальнейшем проводили наблюдения за процессом прорастания и формирования морфологических структур полученных регенерантов. Контрольным вариантом являлись обычные черенки из микрорастений, используемые в процессе клонального микроразмножения.

Цель проводимой работы — изучение влияния инкапсуляции  на сохранность invitroматериала при поддержании активной коллекции и определение периода регенерации микрорастений из инкапсулированной почки.

Сроки хранения законсервированных биокапсул зависят от многих факторов. Их комплексное влияние в течение определенного периода на изучаемый объект оценивается жизнеспособностью исследуемых биокапсул, которое  определяется энергией их прорастания.

В процессе формирования морфогенеза микрорастений из черенков и биокапсул отмечены различия в зависимости от биологии сортов. Полученные регенеранты из биокапсул отличались от микрорастений контрольного варианта по фазам роста и развития. Если период регенерации микрорастений из черенков у сорта Жуковский ранний составляет 21-25 дней, то для регенерантов из биокапсул после хранения в течение 3-6 месяцев потребовались 45-50 дней.  Более длительное хранение привело к увеличению периода регенерации до 55 дней  (таблица).

Таблица —  Оценка биоинкапсулированных микрочеренков в зависимости от срока консервации

 

 

 

 

Сорт

 

 

 

Вариант

Период регенерации, дней Сохран-

 

 

ность, %

Всего в том числе:
прорастание органогенез
Жуковский

 

 

ранний

1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

25

45

50

55

55

 

 

 

5

15

20

25

25

 

 

 

20

30

30

30

30

 

 

 

100

100

80

92

98

Удача 1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

35

55

65

70

85

 

 

 

5

20

25

30

45

 

 

 

30

35

40

40

40

 

 

 

100

98

86

80

60

Метеор 1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

30

45

55

65

75

 

 

 

5

15

25

35

45

 

 

 

25

30

30

30

30

 

 

 

100

100

92

60

40

Невский 1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

30

35

50

60

75

 

 

 

5

10

20

30

45

 

 

 

25

25

30

30

30

 

 

 

100

98

92

92

86

Голубизна 1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

35

55

65

70

85

 

 

 

5

20

25

30

45

 

 

 

30

35

40

40

40

 

 

 

100

100

100

86

80

Никулинский 1.Черенки  invitro- контроль

 

 

2. 3 месяца

3. месяцев

4. 9 месяцев

5. 12 месяцев

 

 

 

30

40

55

70

70

 

 

 

5

10

15

25

25

 

 

 

25

30

40

45

45

 

 

 

100

100

86

60

40

 

 

Различные сроки хранения биоинкапсулированных микрочеренков сортов Удача и Голубизна оказали прямое влияние на период их регенерации после размещения на новую питательную среду. Органогенез данных сортов при клональном микроразмножении  обычно проходит за 30-35 дней.  Использование биокапсул после трех месяцев хранения показало, что исследуемые экспланты проросли на 20-й день пассажа, планомерно прошли все фазы роста и развития  и завершили свой регенерационный цикл на 55-й день. Увеличение периода хранения до 6 и 9 месяцев способствовало удлинению срока регенерации на 5 дней, соответственно. Однако оценка биоинкапсулированного материала по истечению 12-и месяцев отражает существенное увеличение регенерационного периода до 85 дней. При этом стоит отметить, что после длительного хранения фазы роста и развития растений из биокапсул не отличались от предыдущих сроков пассажа, существенно задержалось только прорастание биокапсул. Применительно для вышеуказанных сортов в порядке исполнения применяли субкультивирование биокапсул на 40-й день пассажа на новую питательную среду. Такой элемент технологии применяли при использовании микрочеренков после прохождения периодов хранения 9 и 12 месяцев.

Периоды регенерации биоинкапсулированных почек от разного срока консервации сортов Метеор, Невский и Никулинский существенно не различались, в то время как прорастание и органогенез зависели от сортовых особенностей. В вариантах с более поздним периодом хранения биокапсулы сорта Никулинский характеризовались ускоренным прорастанием, однако в дальнейшем  формирование морфологических структур происходило на 15 дней позже, чем у сортов Метеор и Невский. Таким образом, в конце периода хранения биокапсулы выше исследуемых сортов регенерировали за 70-75дней. Полученные  данные позволяют отметить, что регенерация микрочеренков из биоинкапсулированных почек не зависела от группы спелости исследуемых сортообразцов.

Жизнеспособность инкапсулируемых почек оказалась в прямой зависимости от периода консервации биоматериала. Независимо от сорта, после хранения в течение трех месяцев, степень прорастания биокапсул составила 98-100%. В дальнейшем при определении сохранности invitroмикрочеренков исследуемых сортов наблюдалась четкая динамика снижения жизнеспособности инкапсулированного биоматериала, исключением составил сорт Жуковский ранний. Во второй половине периода  хранения у него были отмечены существенные колебания по данному показателю. Возможно, присутствие такой тенденции можно объяснить повреждением пазушных почек при получении эксплантов или их инкапсуляции.

Сохранность биокапсул в конце срока хранения отражает несущественное варьирование показателей жизнеспособности в зависимости от особенностей исследуемых сортов. Лучшими  результатами характеризовался сорт Жуковский ранний — 98%, у сортов Невский и Голубизна проросшие биокапсулы составили 80-86%.

Анализ полученных результатов позволяют отметить, что консервация invitro микрочеренков и их хранение в виде биокапсул в течение одного календарного года в среднем обеспечило сохранность более 60% законсервированного биоматериала. Полученные регенеранты характеризовались максимальным формированием междоузлья, то есть хорошим коэффициентом размножения invitro, сформировали мощный листовой аппарат и корневую систему.

Интерпретация полученных результатов исследований позволила выявить, что морфогенез микрорастений из биокапсул не зависел от периода их хранения.  Увеличение периода регенерации, при использовании биоматериала с более поздним периодом консервации, было связано с задержкой прорастания законсервированных почек. После образования всходов формирование морфологических структур регенерантов от разных сроков консервации существенно не различались. В то время как жизнеспособность биоинкапсулированных микрочеренков находилась в прямой зависимости от периода консервации. С его увеличением сохранность законсервированного биоматериала снижалась. Однако, такое снижение, учитывая период хранения инкапсулированных почек, позволяет рекомендовать новый способ консервирования invitro материала картофеля для использования при сохранении активной коллекции, сформированной на основе БЗСК [1,2]. Результатами исследований доказано, что на хранение invitro материала в виде биокапсул не оказывало влияние группа спелости, сохранность инкапсулируемого invirtoматериала зависела от биологии исследуемых сортообразцов.

Практическое применение нового метода хранения активной коллекции в виде биокапсул позволяет уменьшить ежегодный объем проводимых работ в БЗСК по введению в культуру и получению новых линий invitro, исключить снижение их качественных характеристик при систематическом черенковании и обеспечить сохранность здорового состояния исходного материала.

 

Литература

 

1.  Овэс Е.В., Линн К., Тома Д.  Использование метода биоинкапсуляции для хранения микрочеренков картофеля invitro.// Картофелеводство: Материалы науч. конф., посвященной 125-летию Н.И. Вавилова. /Рос.акад. с.-х. наук, ВНИИКХ, Сб. науч. тр.  – М., 2012. –С. 113-117.

2. Овэс Е.В., Конг Л. Л. Сохранность биоинкапсулированных микрочеренков при хранении материала invitro //Инновационные аспекты развития картофелеводства : состояние, проблемы и перспективы».Тезисы  науч.-практич. конф. посвященной 85-летию Бел НИИК. Минск. 9-12 июля 2013 г. – Минск, 2013. –  с.62.

3.  Овэс Е.В.,  Ле К.Л. Консервация invitro материала в виде биокапсул //Защита картофеля -№ 1, -2014. – С.25-26

4. Сохранение вегетативно размножаемых культур в invitro- и криоколлекциях./С.Е. Дунаева и др. /Методические указания ВНИИР. -Санкт-Петербург. — 2011.  – 65 с.

5. Сastillo B., Smitn M.A.L.,Yadav U.L. Plant regeneration from encapsulated somatic embryos of Carica papaya L. Plant Cell Report 17, 1998, 172-176.

6. L? C. L. et Collet G. F. Conservation in vitrode l'assortiment suisse des

vari?t?s de Pomme de terre. Rev. suisse Agric.20(5), 1988. 277-281.

7. L?, C.L.Thomas D.; Nowbuth L. Conservation des pommes de terre in vitro et caract?risation de vari?t?s culniv?es tn Suisse. Revue suisse Agric. 34 (3), 2002, 133-136.

8. L?, C.L.Thomas D.; de Joffrey J.-P.;  Tschuy F . Bioencapsulation; production et conservation de semences de pomme de terre miniaturisees in vitro.   Revue suisse Agric. 34 (Jul-Aug), 2003, 199 — 203.