Для эффективного контроля латентной формы инфекции необходима разработка объективных лабораторных методов идентификации и количественного определения фитопатогенов.

Совершенствование схемы контроля патогенов в процессе оригинального семеноводства картофеля предполагает значительное увеличение объемов лабораторного тестирования. В связи с этим к лабораторным методам для рутинных анализов предъявляются определенные требования: наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью ключевое значение имеют производительность, возможность автоматизации, объективного документирования, а также время и себестоимость проведения одного теста (DeBokx, 1972; Torrance, Jones, 1981).

Разработку отечественной тест-системы «сэндвич-варианта» иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляли в 1982-84 гг. в рамках комплексной целевой программы «Биотехнология» на основе совместных исследований Биологического факультета МГУ, Института биоорганической химии РАН и ВНИИКХ (Трофимец, 1989).

В процессе разработки тест-системы для ИФА были решены методические вопросы технологии производства иммуноспецифических препаратов (Трофимец и др., 1985), такие как:

1)       накопление биоматериала, содержащего моноштаммы патогенов, выделенные из природных источников на территории Российской Федерации;

2)       получение высокоочищенных препаратов вирусов и чистых культур возбудителей бактериозов картофеля;

3)       получение высокоспецифических антисывороток из плазмы крови иммунизированных животных (кроликов);

4)       выделение специфических иммуноглобулинов и их конъюгирование с пероксидазой из хрена обыкновенного (ArmoraciarusticanaLam).

 

В результате проведенных исследований были созданы отечественные тест-системы «сэндвич-варианта» ИФА и оптимизированы их параметры для идентификации наиболее распространенных на территории Российской Федерации вирусов: PVX, PVS, PVM, PVY, PAMV, PLRV (Трофимец и др., 1986), PVA (Варицева, Варицев, 1991) и возбудителей бактериозов картофеля: черной ножки (Писарев, Князева, Шнейдер, 1991; Капустин, Князева, 1991)  и кольцевой гнили (Шнейдер, Писарев, Князева, 1991). Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения вирусов составила 10-50 нг/мл, бактерий – 103-105 клеток/мл, что на 2-3 и соответственно на 3-4 порядка превышало чувствительность серологического метода капельной агглютинации.

На основе разработанных тест-систем во ВНИИКХ, начиная с 1985 г., освоено коммерческое производство диагностических наборов для ИФА к 12 патогенам, поражающем картофель.

В состав коммерческих наборов каждого наименования на 1000 определений входят (рис. 1):

— покровный буфер (десятикратный концентрат карбонатного буфера,  законсервированного 0,1 % азидом натрия, рН 9,6) – 1 флакон, 10 мл;

— промывочный буфер (порошкообразная смесь солей, рН 7,4) – 5 флаконов по 22,4 г;

— пробно-конъюгатный буфер /ПКБ/ (десятикратный концентрат фосфатно-солевого  буфера, рН 7,4, законсервированного 0,01 % мертиолятом натрия) – 1 флакон, 20  мл;

Рисунок 1 – Диагностический набор для иммуноферментного определения фитопатогенов картофеля (ВНИИКХ, 2013)

 

— добавки для пробно-конъюгатного буфера /добавки ПКБ/ (сухая смесь обезжиренного молока и поливинилпирролидона Mr44000)  – 1 флакон,  5,0г;

— субстратный буфер (жидкий пятикратный концентрат фосфатно-цитратного буфера, законсервированного 0,01 % мертиолятом натрия, рН 5,0)                  – 1 флакон, 20 мл;

— детергент (Твин-20, жидкий препарат) – 1 флакон, 7 мл;

— субстрат (о-фенилендиамин, кристаллический порошок) – 1 флакон, 40 мг;

— перекись водорода (коммерческий гидропирит в таблетках) – 2 таблетки;

— антитела (кроличьи специфические иммуноглобулины, жидкий концентрат  в 50 % глицерине с 0,01 % мертиолятом натрия) – 1 флакон, 0,25мл;

— конъюгат (кроличьи иммуноглобулины, меченные пероксидазой хрена, жидкий концентрат в 50 % глицерине с 0,01 % мертиолятом натрия)

— 1  флакон, 0,25 мл;

— положительный контроль (очищенный вирус, жидкий концентрат в 50%  глицерине с 0,01 % мертиолятом натрия) – 1 флакон,  0,15 мл;

— отрицательный контроль (сок листьев здорового картофеля в 50 % глицерине с 0,01 % мертиолятом натрия) – 1 флакон,  0,35 мл;

— полистирольные 96 луночные планшеты для иммунологических реакций – 10 шт.;

— инструкция по применению – 1 шт.

В последующие годы проводилась неоднократная качественная модернизация наборов в направлении повышения чувствительности определения и устранения фоновых реакций на основе использования  новых научных и технологических достижений в области аналитической биотехнологии.

При модернизации диагностических наборов ИФА был использован ряд технологических решений, которые затрагивают ключевые компоненты диагностических тест-систем (Блинцов, и др., 2012):

— использование высокоочищенных препаратов высокоспецифичных аффинных антител;

-использование низкомолекулярной фракции конъюгата антител с пероксидазой хрена с мольным соотношением антитело/фермент =1, сохраняющей 60-70% ферментной и 90% иммунологической активности;

— применение новой технологии иммобилизации и стабилизации антител на поверхности полистироловых планшетов с высокой сорбционной емкостью;

— использование готовых к применению компонентов набора (буфер для приготовления тестируемых образцов, иммобилизованные антитела, раствор субстрата, раствор стоп-реагента);

— использование комплекса природных и синтетических детергентов для буферных растворов с целью повышения специфичности иммунохимических взаимодействий в аналитической системе;

— применение новой технологии хранения готовой для использования двухкомпонентной субстратной смеси (тетраметилбензидин и пероксид водорода) в водном растворе.

Современные отечественные диагностические наборы для ИФА характеризуются (Блинцов и др., 2013):

— высокой стабильностью реагентов набора на основе использования новой технологии стабилизации иммобилизованных антител (срок годности набора – 12 месяцев);

— комплектацией набора готовыми к применению реагентами (планшетов с иммобилизованными антителами, буферные растворы, субстратная смесь на основе тетраметилбензидина и пероксида водорода, раствор стоп-реагента), не требующими дополнительной подготовки перед проведением анализа;

— возможностью проведения небольшого количества анализов в разные дни за счет использования стрипованных планшетов и фасовкой всех реагентов в форме жидкости;

— возможностью как визуальной, так и инструментальной при длине волны 450 нм диагностики результатов анализа;

— высокой специфичностью анализа – количество перекрестных реакций с гетерологичными вирусами и бактериальными препаратами не превышает 0,01%;

— высокой чувствительностью детекции вирусных и бактериальных антигенов (минимальная концентрация антигена, определяемая с помощью набора, составляет не более 1 нг/мл для вирусов и не более 102 клеток/мл для бактериальных антигенов);

— высокой воспроизводимостью анализа (коэффициент вариации результатов определения патогена в одном и том же тестируемом образце не превышает 10%);

— высокой точностью анализа (доля отрицательных результатов определения для проб, отрицательных по определяемому антигену, не менее 95%);

— широким диапазоном измерений (диапазон концентраций определяемого антигена от 1 до 1000 нг/мл для вирусов и 14-108 клеток/мл для бактерий) без проявления «хук»-эффекта в области высоких концентраций определяемого фитопатогена;

— полное время анализа составляет не более 3 часов.

С 1985 года диагностические наборы для ИФА производятся и реализуются по договорам научно-исследовательским учреждениям и семеноводческим хозяйствам. В 1986 г. было реализовано 1150 наборов в 119 учреждений, среди которых отраслевые НИИ России, Украины, Белоруссии, Прибалтики, Молдавии, высшие учебные заведения, научно-исследовательские учреждения РАН СССР, Сибирское и Дальневосточное отделение ВАСХНИЛ, сельскохозяйственные опытные хозяйства и станции, совхозы.

До 1990 года при централизованной системе обеспечения потребностей селекционно-семеноводческих учреждений Советского Союза производство диагностикумов для ИФА и антисывороток для капельной серодиагностики в сумме обеспечивало ежегодно выполнение порядка 4 млн. анализов в 120 профильных организациях.

В дальнейшем после распада Советского Союза в период становления в Российской Федерации рыночной экономики спрос и объемы реализации диагностических средств значительно уменьшились (таблица 1).

В период 1991-1995 гг. производство и реализация диагностических наборов для ИФА сократились в 10 раз: с 1400 шт. в 1991 г. до 140 наборов в 1995 году. Одновременно, последовательно уменьшалась реализация диагностических антисывороток для капельной серодиагностики: 1991 г. – 730 флаконов, 1992 г. – 588 флаконов, 1993 г. – 420 флаконов, 1994 г. – 402 флакона, 1995 г. – 312 флаконов.

Таблица 1 – Объемы реализации диагностических наборов для ИФА, 1991-1995 гг.

 

Патоген Количество наборов, шт.
1991г. 1992 г. 1993 г. 1994 г. 1995 г. 1991-1995 гг.
PVX 121 29 21 10 8 189
PVS 74 19 15 11 10 129
PVM 118 20 18 10 8 174
PVY 208 136 106 56 25 531
PVA (поли) 74 74
PVA (поли/моно) 26 25 5 5 61
PVF 49 34 20 103
PLRV 246 151 114 55 28 594
APLV 33 8 2 43
TMV 66 8 5 5 5 89
PV(X+M+S+F) 232 173 140 70 30 645
Черная ножка 89 34 24 14 11 172
Кольцевая гниль 90 32 22 10 10 164
Всего: 1400 670 512 246 140 2968

 

За период 1996-2000 гг. было реализовано иммуноферментных наборов и диагностических антисывороток соответственно на 0,46 и 1,19 млн. анализов. В двухтысячных годах спрос на диагностические наборы для ИФА стабилизировался, а на антисыворотки – продолжал снижаться (таблица 2).

 

Таблица 2 – Объемы реализации иммунодиагностических средств, произведенных ВНИИКХ, млн.анализов

 

Продукция

 

 

 

Период
1996-

 

 

2000 гг.

2001-

 

 

2005 гг.

2006-

 

 

2010 гг.

2011-2012 гг.
Наборы ИФА 0,46 0,56 0,45 0,20
Диагностические антисыворотки 1,19 1,35 0,92 0,17

 

В настоящее время диагностические наборы для определения вирусов и возбудителей бактериозов картофеля производства ГНУ ВНИИКХ Россельхозакадемии являются лидирующими и доминирующими на отечественном рынке аналогичных иммунохимических тестов. Диагностические средства производятся в объеме, обеспечивающем ежегодно проведение порядка 300-500 тыс. определений в системе контроля качества и сертификации семенного картофеля.

При работе с семенным материалом в полевых питомниках важная роль отводится экспресс-диагностике патогенов в целях первичной оценки качества базовых клонов и их отбора для дальнейшего размножения (Анисимов и др., 2008; Овэс, Топышева, Анисимов, 2009).

Отечественные иммунохроматографические тест-системы для визуальной  экспресс-диагностики  вирусных инфекций картофеля на поликомпозитных мембранных тест-полосках  разрабатывали  в 2008-2010 гг. в рамках совместного проекта кафедры вирусологии биологического факультета МГУ,  ИФХБ им.А.Н.Белозерского, ЗАО НВО "Иммунотех" и ВНИИКХ.

В результате проведенных исследований были сконструированы мультимембранные поликомпозитные иммунохроматографические стрипы с линейной формой движения фронта раствора (рис.2), определены условия проведения иммунохроматографической реакции и оптимизированы кинетические параметры работы тест-системы на основе использования наночастиц коллоидного золота в качестве визуального маркера специфических антител (Блинцов и др., 2008, Dryginetal, 2012).

При постановке реакции в неосветленных листовых экстрактах не было обнаружено существенного влияния эндогенных микро- и макрокомпонентов растительного сока на результаты проводимых измерений (Дрыгин и др.,2009). Окрашенные пигменты сока листьев практически полностью задерживались на впитывающей мембране и не мешали инструментальной и визуальной оценке результатов анализа.

Появление окрашенной аналитической линии указывает на инфекцию.

Рисунок 2 – Схема экспресс- определения фитопатогенов на иммунохроматографических тест-полосках

Мембраны после проведения анализа сохраняют первоначальную окраску в аналитической и контрольной зонах длительное время и могут быть сканированы  для количественной оценки результатов полевого теститрования с помощью отражательного фотометра. Повторное измерение интенсивности окраски полосок через 2 недели  показало незначительное снижение интенсивности регистрируемого сигнала (не более 15%) по сравнению с данными, сканированными в день проведения анализа  (Дрыгин и др., 2009).

В результате проведенных в исследований были созданы отечественные иммунохроматографические тест-системы и отработаны методические аспекты их применения для экспресс диагностики Х-, М- и Y-вирусов картофеля. По результатам испытаний чувствительность выявления вирусов в образцах составила 2-8 нг/мл, а время детекции – 10-20 мин. (Кравченко, Усков, Варицев, 2009, Дрыгин и др., 2012).

На основе разработанных отечественных тест-систем для экспресс- определения вирусов картофеля методом иммунохроматографии на тест- полосках созданы диагностические наборы (4 наменовния), рассчитанные на проведение 50 анализов. В состав набора входят:

— диагностические тест-полоски в пластиковом планшете (иммуно-стрипы) – 50 шт.;

— экстрагирующий буфер (0,01М калий-фосфатный буфер, рН 7,2—7,5, содержащий 0,1М NaСI, 0,1% Тритон Х-100) —  пластиковый флакон, 250 мл;

— отрицательный контроль (сок листьев здорового картофеля в 50 % глицерине с 0,01 % мертиолятом натрия) – 1 флакон,  0,35 мл;

— пластиковые пакеты 12х14 см с мерной линией – 50 шт.;

— сетки для растирания биопробы, 10х10 см – 50 шт.;

— инструкция по применению – 1 шт.

Тест-набор не содержит токсичных и опасных компонентов.Срок годности набора – 12 месяцев при 40С в исходной упаковке.

Производственные испытания показали высокую эффективность использования иммунохроматографических тест-полосок при отборе базовых клонов в Банке здоровых сортов ВНИИКХ. Среди анализируемых образцов были выявлены:  PVX – в 23 клонах, PVY – в 15 клонах, PVM – в 21 клоне.

Клоны 17-ти сортов с отрицательной реакцией на присутствие вирусов по данным иммунохроматографии были дополнительно проанализированы с использованием глазкового теста ИФА (таблица 3).

Из 86 клонов всех сортов свободных от вирусов по результатам полевого анализа 79 оказались свободными от вирусов по результатам послеуборочного ИФА. Совпадение результатов тестирования материала методами ИФА и ИХА составило 92%, что было на уровне совпадений результатов тестирования в лабораторных условиях.

X-вирус картофеля при использовании послеуборочного теста (ИФА) дополнительно был выявлен в двух клонах сорта Раменский, который оказался полностью инфицирован PVX. Клоны сортов Удача, Ладожский, Накра, Роко, Лорх, Голубизна с положительной реакцией на PVX были полностью отбракованы при полевом тестировании с использованием иммунохроматографических тест-полосок.

 

Таблица 3 – Результаты дополнительного тестирования отобранных базовых клонов методом ИФА

 

Сорт Кол-во клонов, шт. Выявлено клонов с вирусами методом ИХГА, шт. Кол-во безвирус. клонов, отобран-ных для глазково-го теста, шт. Выявлено

 

 

дополни-тельно клонов с вирусами методом ИФА, шт.

Кол-во безвирус.клонов после глазково-го теста, шт.
Х М У Х М У
Розара 10 0 0 1 7 0 0 1 6
Невский 10 0 2 3 5 0 0 0 5
Удача 10 1 1 0 3 0 0 0 3
Никулинский 10 0 1 0 5 0 1 0 4
Холмогорский 10 0 0 4 4 0 0 1 3
Ладожский 10 3 2 1 3 0 0 1 2
Накра 10 1 1 0 5 0 0 0 5
Раменский 10 8 0 0 2 2 1 0 0
Ред Скарлетт 10 0 0 0 7 0 0 0 7
Ильинский 10 0 0 0 5 0 0 0 5
Роко 10 2 0 0 3 0 0 0 3
Чародей 10 0 0 0 8 0 0 0 8
Наяда 10 0 0 0 5 0 0 0 5
Любава 10 0 0 0 7 0 0 0 7
Лорх 10 1 1 2 5 0 0 0 5
Голубизна 10 1 2 0 4 0 1 0 3
Каратоп 10 0 0 0 8 0 0 0 8
Всего 170 17 10 11 86 2 3 3 79

 

PVM был дополнительно выявлен методом ИФА в клонах сортов Никулинский (один клон), Голубизна (один клон) и Раменский (один клон).

Y-вирус картофеля в послеуборочных пробах был дополнительно обнаружен методом ИФА в клонах сортов Розара, Холмогорский и Ладожский.

Характерно, что сорта, клоны которых были полностью свободны от вирусов по результатам ИХА (Каратоп, Наяда, Ред Скарлетт, Любава, Чародей, Ильинский) подтвердили отсутствие вирусов и по результатам послеуборочного теста (ИФА).

В 2008-2009 гг. с использованием отечественных иммунохроматогра-фических стрипов было отобрано 590 клонов 37 сортов, поддерживаемых в Банке здоровых сортов картофеля (Архангельская область).

 

 

А.И. Усков1, Ю.А. Варицев1, Г.П. Варицева1, Д.В.Кравченко1, П.А.Галушка1, Е.В.Овэс1, Б.В.Анисимов1, Ю.Ф.Дрыгин2, А.Н.Блинцов2, А.П.Осипов2, В.Г.Григоренко2,  И.П.Андреева2, И.Г.Атабеков2

1 Всероссийский НИИ картофельного хозяйства имени  А.Г. Лорха

2МГУ им. М.В.Ломоносова

 

 

Литература

  1. Анисимов Б.В., Овес Е.В., Юрлова С.М., Алябьева А.В., Хутинаев О.С., Бойко Ю.П., Абашкин О.В., Абросимов Д.В. Совершенствование системы качества в процессе производста семенного картофеля. В кн.: Картофелеводство: результаты исследований, инновации, практический опыт. Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. – М., 2008. – Т.1. – с.278-289.
  2. Блинцов А.Н., Дрыгин Ю.Ф., Григоренко В.Г., Андреева И.П., Осипов А.П., Атабеков И.Г.. Инновационная технология экспресс-диагностики вирусных инфекций растений методом иммунохроматографии на тест-полосках. В кн.: Картофелеводство: результаты исследований, инновации, практический опыт. Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» / Рос.акад.с.-х.наук, Всерос.НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. – М., 2008. – Т.1.- 290-297.
  3. Блинцов А.Н., Варицев Ю.А., Усков А.И., Варицева Г.П., Зайцев И.А., Ерохова М.Д., Еланский С.Н., Комаров А.Б., Анисимов Б.В. Диагностические наборы нового поколения для иммуноферментного определения возбудителей вирусных и бактериальных болезней картофеля. В кн.: Картофелеводство. Сборник научных трудов. Материалы научной конференции «Мировые генетические ресурсы картофеля и их использование в современных направлениях селекции» (к 125-летию со дня рождения Н.И.Вавилова) / Россельхозакадемия Всерос. НИИ картоф. хоз-ва. – М., 2012. – с.103-112.
  4. Блинцов А.Н., Варицев Ю.А., Усков А.И., Варицева Г.П., Зайцев И.А., Ерохова М.Д., Еланский С.Н., Комаров А.Б., Анисимов Б.В. Новые диагностические тест-системы для иммуноферментного определения возбудителей вирусных и бактериальных болезней картофеля. В кн.: Состояние и перспективы Инновационного развития современной индустрии картофеля. — Чебоксары: КУП ЧР «Агро-инновации», 2013.  — с.76-81.
  5. Варицева Г.П., Варицев Ю.А. А-вирус картофеля: выделение, получение антисыворотки, иммуноферментный анализ. В кн.: Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. / Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва.  – М., 1991. – вып.53. -с.57-62 .

6. Дрыгин Ю.Ф., Блинцов А.Н., Осипов А.П., Григоренко В.Г., Андреева И.П., Усков А.И., Варицев Ю.А., Анисимов Б.В., Новиков В.К., Атабеков И.Г. Высокочувствительный иммунохроматографический экспресс-метод определения зараженности растений вирусом табачной мозаики. // Биохимия, 2009. – т.74.- вып.9. – с.1212-1220.

7. Дрыгин Ю.Ф., Блинцов А.Н., Атабеков И.Г., Осипов А.П., Григоренко В.Г., Андреева И.П., Кравченко Д.В., Варицев Ю.А., Усков А.И. Экспресс-диагностика вирусов картофеля методом иммунохроматографии на тест-полосках. // Картофель и овощи, 2012. — №5. – с.27-28.

8. Капустин М.Н., Князева В.П. Диагностика бактериальных заболеваний клубней картофеля с помощью иммуноферментного анализа. В кн.: Технология производства картофеля. Научные труды. / Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва. – М., 1991. – вып.54. -с.23-24.

9. Кравченко Д.В., Усков А.И., Варицев Ю.А., Овэс Е.В. Возможности использования иммунохроматографических тест-систем для диагностики вирусов картофеля. В кн.: Картофелеводство: Сборник научных трудов.  Материалы координационного совещания и научно-практической конференции, посвященной 120-летию со дня рождения А.Г.Лорха / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. – М., 2009. – с.208-213.

10. Овэс Е.В., Топышева О.В., Анисимов Б.В. Продуктивность сортообразцов картофеля при отборе базовых клонов в условиях Архангельской области. В кн.: Картофелеводство: Сборник научных трудов. Материалы координационного совещания и научно-практической конференции, посвященной 120-летию со для рождения А.Г.Лорха /Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. – М., 2009. – с.193-199.

11. Писарев В.Б., Князева В.П., Шнейдер А.Ю. Использование иммуноферментного анализа для диагностики латентной формы возбудителя черной ножки. В кн.: Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. / Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва.  – М., 1991. – вып.53. -с.74-78 .

12. Трофимец Л.Н, Замотаев А.И., Варицев Ю.А., Князева В.П., Герасимова К.Ф., Усков А.И., Бабоша А.В., Егорова Л.И., Русинова Е.Я. Иммуноферментный метод диагностики. // Защита растений, 1985. — №11.  – с.8-10.

13. Трофимец Л.Н., Варицев Ю.А., Князева В.П., Герасимова К.Ф., Усков А.И., Бабоша А.В., Зимина Л.Б., Егорова Л.И., Русинова Е.Я., Плетнева В.А. Разработка и применение метода иммуноферментного анализа для диагностики вирусных и бактериальных болезней картофеля. В кн.: Селекция картофеля на иммунитет и защита от болезней и вредителей. Научные труды. / Госагропром РСФСР, НИИ картоф. хоз-ва. – М., 1986. – с.42-50.

14. Трофимец Л.Н. Биотехнология в картофелеводстве. –М., 1989.–45 с.

15. Шнейдер А.Ю., Писарев В.Б., Князева В.П. Использование иммуноферментного анализа для диагностики кольцевой гнили картофеля. В кн.: Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. / Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва.  – М., 1991. – вып.53. -с.79-84.

16. De Bokx J.A. Test plants. In: Viruses of potato and seed potato production. / De Bokx J.A. (Ed.) – Centre for Agr. Pub. and Doc., Wageningen, The Netherlands, 1972. – p.102-110.

17. Drygin Yu.F., Blintcov A.N., Grigorenko V.G., Andreeva I.P., Osipov A.P., Varitzev Yu.A., Uskov A.I., Kravchenko D.V., Atabekov J.G. Highly sensitive field test lateral flow immunodiagnostics of PVX infection. // Applied Microbiology and Biotechnology, 2012. – v.93.- №1. – p.179-189.

18. Torrance L., Jones R.A.C. Recent developments in serological methods suited for use in routine testing for plant viruses. // Plant Pathology, 1981. – v.30. – p.1-24.